一、引言

隨著現(xiàn)代生物技術的飛速發(fā)展，植物基因工程在作物改良領域展現(xiàn)出了巨大的潛力。煙草作為一種重要的經濟作物，其品質改良一直是研究的熱點。在眾多品質特征中，甜度是一個具有特殊意義的性狀。超甜基因的發(fā)現(xiàn)為煙草甜度的提升帶來了新的機遇。在自然界中，某些植物含有能編碼高甜度蛋白或酶的基因，這些超甜基因可以使植物產生更好的甜味。將超甜基因導入煙草，有望改變煙草的口感和風味，為煙草行業(yè)開辟新的發(fā)展方向，例如開發(fā)出具有特殊風味的新型煙草制品，滿足消費者對更好口味的需求。此外，從科學研究角度來看，這一應用也有助于深入理解基因與植物代謝途徑之間的相互作用，以及基因在異源植物中的表達調控機制。

二、材料與方法

（一）材料

植物材料

選用煙草品種（如 NC89）作為實驗受體植物，其種子經過消毒處理后，在無菌培養(yǎng)基上發(fā)芽并培養(yǎng)至合適的苗齡用于轉化。

基因材料

從具有高甜度特性的植物（如甜葉菊）中克隆超甜基因。通過對甜葉菊基因組數(shù)據庫的分析和基因序列比對，確定目標超甜基因（如甜菊糖苷合成相關基因）的序列信息。然后設計特異性引物，從甜葉菊葉片組織中提取總 RNA，利用反轉錄 - PCR（RT - PCR）技術擴增得到超甜基因的 cDNA。

載體與菌株

選用合適的植物表達載體（如 pBI121），其含有 CaMV 35S 強啟動子、多克隆位點和篩選標記基因（如卡那霉素抗性基因）。將載體轉化至農桿菌菌株（如 EHA105）中，用于后續(xù)的煙草轉化。

（二）方法

超甜基因克隆與載體構建

基因克隆：提取甜葉菊葉片總 RNA，使用高質量的反轉錄酶將其反轉錄為 cDNA。以 cDNA 為模板，根據設計的特異性引物進行 PCR 擴增。PCR 反應條件經過優(yōu)化，包括合適的退火溫度、延伸時間等。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收目的條帶。

載體構建：將回收的超甜基因片段和植物表達載體分別用相同的限制性內切酶進行雙酶切，然后在 T4 DNA 連接酶的作用下將超甜基因片段連接到植物表達載體上。連接產物轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞（如 DH5α）中，通過抗性篩選和菌落 PCR 鑒定陽性克隆，提取重組質粒進行酶切驗證和測序分析，確保超甜基因正確插入載體。

農桿菌介導的煙草轉化

農桿菌培養(yǎng)與侵染液制備：將含有重組質粒的農桿菌菌株接種于含有相應抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中，在 28℃、200rpm 的條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后收集農桿菌細胞，用侵染緩沖液（如含有乙酰丁香酮的 MS 液體培養(yǎng)基）重懸至合適的濃度。

煙草轉化：選取生長健壯、葉齡適中的煙草葉片，用無菌手術刀將葉片切成小塊（約 0.5 - 1cm2）。將葉片小塊放入農桿菌侵染液中，浸泡一定時間（如 10 - 15 分鐘），期間不斷輕輕搖動。侵染完成后，用無菌濾紙吸干葉片表面多余的農桿菌液。

共培養(yǎng)與篩選：將侵染后的煙草葉片接種在共培養(yǎng)培養(yǎng)基（如 MS 培養(yǎng)基添加一定濃度的乙酰丁香酮）上，在黑暗條件下 25℃共培養(yǎng) 2 - 3 天。之后，將葉片轉移至含有篩選抗生素（如卡那霉素）的選擇培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)。每隔 2 - 3 周將長出的抗性愈傷組織轉移至新的篩選培養(yǎng)基上，直至分化出抗性芽。

轉基因煙草的分子檢測

DNA 提取與 PCR 檢測：提取轉基因煙草葉片的基因組 DNA，以其為模板，使用超甜基因特異性引物進行 PCR 檢測。同時，以未轉化的煙草基因組 DNA 作為陰性對照，以含有重組質粒的 DNA 作為陽性對照。通過 PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳分析，判斷超甜基因是否整合到煙草基因組中。

Southern blotting 檢測：對 PCR 陽性的轉基因煙草植株進一步進行 Southern blotting 分析。提取基因組 DNA，用合適的限制性內切酶進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉膜至尼龍膜上。以標記的超甜基因片段為探針，進行雜交反應。通過檢測雜交信號，確定超甜基因在煙草基因組中的拷貝數(shù)。

RT - PCR 和 Northern blotting 檢測：提取轉基因煙草葉片的總 RNA，進行 RT - PCR 檢測，分析超甜基因在轉錄水平的表達情況。同時，對部分樣品進行 Northern blotting 分析，進一步確定超甜基因轉錄產物的大小和表達量。

轉基因煙草的表型分析與甜度檢測

生長表型觀察：在轉基因煙草植株的整個生長周期中，觀察其植株形態(tài)、葉片大小、顏色等表型特征，并與野生型煙草進行對比。記錄轉基因煙草在生長速度、分枝數(shù)量等方面的變化。

甜度檢測：在煙草植株生長至成熟階段，采集葉片樣本，采用多種甜度檢測方法進行分析。例如，使用高效液相色譜（HPLC）技術檢測葉片中糖類物質（如葡萄糖、果糖、蔗糖等）的含量變化。同時，通過感官評價實驗，邀請專業(yè)評吸人員對轉基因煙草和野生型煙草進行口感評價，評估超甜基因導入對煙草甜度和風味的影響。

三、結果

（一）超甜基因克隆與載體構建

通過 RT - PCR 成功擴增出目標超甜基因片段，其大小與預期相符。經過載體構建和驗證，測序結果表明超甜基因準確插入植物表達載體中，且閱讀框完整，為后續(xù)的煙草轉化奠定了基礎。

（二）農桿菌介導的煙草轉化與篩選

經過農桿菌侵染和篩選培養(yǎng)，在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上獲得了抗性愈傷組織，并進一步分化出抗性芽。經過多次繼代篩選，獲得了多個獨立的轉基因煙草株系。

（三）轉基因煙草的分子檢測

DNA 檢測結果

PCR 檢測顯示，部分轉基因煙草植株能夠擴增出與超甜基因大小一致的條帶，而陰性對照無此條帶，表明超甜基因已整合到煙草基因組中。Southern blotting 分析結果進一步確定了超甜基因在不同轉基因株系中的拷貝數(shù)存在差異，從單拷貝到多拷貝不等。

RNA 檢測結果

RT - PCR 和 Northern blotting 檢測結果表明，超甜基因在轉錄水平在大部分轉基因煙草植株中得到表達，但表達量在不同株系間有所不同。

（四）轉基因煙草的表型分析與甜度檢測

生長表型

在生長過程中，部分轉基因煙草株系與野生型煙草相比，在植株高度、葉片大小和顏色等方面未出現(xiàn)明顯異常，但有少數(shù)株系表現(xiàn)出輕微的生長遲緩現(xiàn)象，可能與超甜基因的插入和表達對植物代謝的影響有關。

甜度檢測結果

HPLC 分析結果顯示，轉基因煙草葉片中的糖類物質含量在某些株系中有顯著增加，尤其是與甜度相關的蔗糖和果糖含量。感官評價實驗結果表明，部分轉基因煙草具有明顯的甜味增強效果，口感更加醇厚，表明超甜基因在煙草中的表達成功改變了煙草的甜度和風味。

四、討論

（一）基因工程技術在煙草品質改良中的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

通過植物基因工程將超甜基因導入煙草，為煙草品質改良提供了一種精準、高效的方法。與傳統(tǒng)的育種方法相比，基因工程可以突破物種間的生殖隔離，快速引入特定的優(yōu)良基因。然而，在實驗過程中也面臨著一些挑戰(zhàn)，如基因沉默現(xiàn)象、基因插入對植物基因組的潛在影響等。在本研究中，發(fā)現(xiàn)部分轉基因株系中超甜基因表達量較低或出現(xiàn)生長異?，F(xiàn)象，可能與基因沉默或插入位點效應有關，需要進一步深入研究。

（二）超甜基因對煙草代謝途徑的影響

超甜基因在煙草中的表達導致了糖類物質含量的變化，這表明超甜基因可能參與或影響了煙草的糖代謝途徑?？赡芡ㄟ^調節(jié)糖類合成相關基因的表達或影響糖類的運輸和積累過程，來改變煙草葉片中的糖分組成。進一步研究超甜基因與煙草內源代謝途徑的相互作用機制，對于深入理解基因工程對植物品質的影響具有重要意義。

（三）轉基因煙草在煙草行業(yè)中的應用前景與安全性考慮

從應用前景來看，具有增強甜度的轉基因煙草可以為新型煙草產品的開發(fā)提供新的原料選擇，滿足消費者對特殊口味煙草產品的需求。然而，轉基因煙草的商業(yè)化應用需要充分考慮其安全性問題，包括對環(huán)境的影響和對人類健康的潛在風險。需要進一步開展長期的環(huán)境釋放試驗和毒理學研究，確保轉基因煙草的安全應用。

五、結論

本研究成功地將超甜基因通過基因工程技術導入煙草，并獲得了轉基因煙草株系。通過分子檢測和表型分析，證實了超甜基因在煙草基因組中的整合和表達，以及對煙草甜度和風味的積極影響。雖然在研究過程中發(fā)現(xiàn)了一些問題，但本研究為煙草品質改良和植物基因工程在煙草行業(yè)的應用提供了有價值的參考，為進一步開發(fā)新型煙草產品和深入研究基因 - 植物代謝相互作用機制奠定了基礎。未來需要進一步優(yōu)化基因工程技術，深入研究超甜基因的作用機制，并全面評估轉基因煙草的安全性，以推動煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。