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多聚賴氨酸硅納米制備及轉染實驗研究

更新時間:2024-11-13      點擊次數(shù):224

一、引言

 

在現(xiàn)代生物醫(yī)學研究領域,基因治療作為一種潛力的治療手段受到了廣泛關注?;蛑委煹年P鍵在于高效、安全的基因傳遞載體,能夠將治療性基因準確地遞送至靶細胞并實現(xiàn)有效的表達。傳統(tǒng)的病毒載體雖然轉染效率較高,但存在免疫原性、潛在致癌性等安全隱患。因此,非病毒載體的研發(fā)成為了當前研究的熱點。

 

納米材料由于其更好的物理化學性質,如小尺寸效應、表面效應等,在基因傳遞領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力。其中,硅納米材料因其良好的生物相容性、易于表面修飾等優(yōu)點而備受青睞。多聚賴氨酸(PLL)作為一種陽離子聚合物,具有與核酸分子靜電相互作用的能力,可有效壓縮和保護核酸。將多聚賴氨酸與硅納米材料結合,有望制備出一種新型的高效、低毒的基因轉染載體。本研究旨在制備多聚賴氨酸硅納米(PLL - SiNPs),并對其轉染性能進行深入研究。

二、材料與方法

(一)材料

 

正硅酸乙酯(TEOS)、氨水(NH??H?O)、多聚賴氨酸(PLL,不同分子量)、熒光標記的 DNAF - DNA)、細胞培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、3 - 4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基) - 2,5 - 二苯基四氮唑溴鹽(MTT)等。實驗所用細胞系包括 HeLa 細胞和 293T 細胞。

(二)多聚賴氨酸硅納米(PLL - SiNPs)的制備

 

 

硅納米顆粒(SiNPs)的合成
在乙醇 - 水混合溶液中,以氨水為催化劑,通過正硅酸乙酯(TEOS)的水解和縮聚反應制備硅納米顆粒。具體步驟如下:將一定量的乙醇、水和氨水混合均勻,在劇烈攪拌下緩慢滴加 TEOS。反應在室溫下持續(xù)一定時間后,通過離心收集生成的 SiNPs,并用乙醇多次洗滌以去除雜質,最后將 SiNPs 分散在去離子水中備用。

 

 

多聚賴氨酸修飾硅納米顆粒(PLL - SiNPs)的制備
將合成的 SiNPs 分散液與不同濃度的多聚賴氨酸溶液混合,在特定的 pH 和溫度條件下反應一定時間。反應過程中,多聚賴氨酸通過靜電作用和化學鍵合(如氨基與硅羥基之間的反應)等方式結合到硅納米顆粒表面。反應結束后,通過離心和透析等方法去除未結合的多聚賴氨酸,得到 PLL - SiNPs 分散液。

 

(三)PLL - SiNPs 的表征

 

粒徑和 zeta 電位測定
使用動態(tài)光散射儀(DLS)測量 PLL - SiNPs 的粒徑大小和粒徑分布,同時測定其 zeta 電位,以評估其表面電荷性質。

形態(tài)觀察
通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察 PLL - SiNPs 的微觀形態(tài),包括顆粒的形狀、大小和分散情況。

傅里葉變換紅外光譜(FT - IR)分析
采用 FT - IR 光譜儀對 PLL - SiNPs 進行分析,通過對比 SiNPs PLL - SiNPs 的紅外光譜,確定多聚賴氨酸與硅納米顆粒之間的化學鍵合情況。

(四)細胞培養(yǎng)與轉染實驗

 

 

細胞培養(yǎng)
HeLa 細胞和 293T 細胞分別接種于含有適量胎牛血清和抗生素的 DMEM 培養(yǎng)基中,在 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至合適密度時,進行傳代培養(yǎng)。

 

 

轉染實驗
將不同濃度的 PLL - SiNPs 與熒光標記的 DNAF - DNA)混合,在特定條件下孵育一定時間,形成 PLL - SiNPs/F - DNA 復合物。然后將復合物加入到培養(yǎng)的細胞中,繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。轉染結束后,使用熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光信號,以評估轉染效率。同時,設置不同的對照組,如僅加 DNA 組、僅加 PLL - SiNPs 組、陽性對照組(使用已知轉染試劑)等。

 

(五)細胞毒性評估

 

采用 MTT 法評估 PLL - SiNPs 的細胞毒性。將不同濃度的 PLL - SiNPs 加入到培養(yǎng)的細胞中,培養(yǎng)一定時間后,加入 MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)。然后去除上清液,加入二甲基亞砜(DMSO)溶解結晶物,使用酶標儀測定吸光度值。根據(jù)吸光度值計算細胞存活率,以評估 PLL - SiNPs 對細胞的毒性作用。

三、結果與討論

(一)PLL - SiNPs 的表征結果

 

粒徑和 zeta 電位
DLS 測量結果顯示,制備的 PLL - SiNPs 粒徑分布較為均勻,平均粒徑在一定范圍內(具體數(shù)值根據(jù)實驗數(shù)據(jù))。zeta 電位分析表明,PLL - SiNPs 表面帶有正電荷,這有利于其與帶負電荷的 DNA 之間的靜電相互作用。隨著多聚賴氨酸修飾量的增加,粒徑略有增大,zeta 電位也相應升高,這與多聚賴氨酸的結合情況相符。

形態(tài)觀察
TEM 圖像顯示,PLL - SiNPs 呈球形,分散良好,無明顯團聚現(xiàn)象。納米顆粒的尺寸與 DLS 測量結果基本一致,表面較為光滑,說明多聚賴氨酸的修飾并未對硅納米顆粒的形態(tài)產生顯著影響。

FT - IR 分析
FT - IR 光譜結果顯示,PLL - SiNPs 在特定波數(shù)處出現(xiàn)了多聚賴氨酸的特征吸收峰,與純多聚賴氨酸和 SiNPs 的光譜相比,證實了多聚賴氨酸成功修飾到硅納米顆粒表面。同時,一些化學鍵的變化也表明了兩者之間存在化學鍵合作用,這為 PLL - SiNPs 的穩(wěn)定性提供了保障。

(二)轉染效率評估

 

熒光顯微鏡觀察結果表明,PLL - SiNPs/F - DNA 復合物能夠有效地將熒光標記的 DNA 遞送至細胞內。在一定濃度范圍內,轉染效率隨著 PLL - SiNPs 濃度的增加而升高。與對照組相比,PLL - SiNPs 表現(xiàn)出較高的轉染效率,尤其在優(yōu)化的實驗條件下,其轉染效率接近甚至在某些細胞系中超過了陽性對照組的轉染試劑。不同細胞系對 PLL - SiNPs 的轉染效率有所差異,這可能與細胞的類型、膜表面性質等因素有關。

(三)細胞毒性分析

 

MTT 法測定的細胞存活率結果顯示,在較低濃度下,PLL - SiNPs HeLa 細胞和 293T 細胞的毒性較低,細胞存活率較高。隨著 PLL - SiNPs 濃度的增加,細胞存活率逐漸降低,但在一定濃度范圍內仍保持在可接受的水平。與傳統(tǒng)的轉染試劑相比,PLL - SiNPs 在相同轉染效率下表現(xiàn)出更低的細胞毒性,這表明其在生物醫(yī)學應用中的安全性優(yōu)勢。

四、結論

 

本研究成功制備了多聚賴氨酸硅納米(PLL - SiNPs),并對其物理化學性質、轉染效率和細胞毒性進行了全面研究。結果表明,所制備的 PLL - SiNPs 具有合適的粒徑、正表面電荷和良好的穩(wěn)定性。在細胞轉染實驗中,PLL - SiNPs 表現(xiàn)出較高的轉染效率和較低的細胞毒性,在基因治療和生物醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。然而,進一步的研究仍需優(yōu)化其制備工藝,提高轉染效率,降低細胞毒性,并深入探究其在體內的生物分布、代謝等情況,為其臨床應用奠定更堅實的基礎。同時,本研究為新型基因轉染載體的研發(fā)提供了新的思路和方法,有望推動基因治療技術的發(fā)展。

 

在未來的研究中,可以考慮對多聚賴氨酸的分子量、硅納米顆粒的尺寸等參數(shù)進行更精細的調控,以進一步優(yōu)化 PLL - SiNPs 的性能。此外,還可以探索與其他功能分子或材料的聯(lián)合應用,賦予 PLL - SiNPs 更多的功能,如靶向性、可降解性等,從而更好地滿足基因治療的復雜需求。